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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是目前电泳法变性分离蛋白质的主要方法，但是单独配制各种溶液十分繁琐，为了解决此问题，本公司开发了本试剂盒。

• 一站式，即开即用，用户不需单独准备各种成分，十分方便。
  
• 安全，将实验人员接触粉末状丙烯酰胺的可能降到最低。
  
• 灵活，用于可以用30%的丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺母液，自行配制各种浓度的PAGE胶，满足分离不同大小蛋白质的需求。
  
• 电泳后可直接用于考染、银染、Western杂交等实验。

• 在本制品提供的装有57g丙烯酰胺/3g甲叉双丙烯酰胺干粉的瓶中加入146mL自备的去离子水，充分摇晃10～20分钟即得200mL 30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺（19:1）溶液（以下简称30%AB溶液）。丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺比例在19:1时，PAGE胶的孔径最小，分辨率最高。配好的30% AB溶液最好4℃避光保存并在1月内用完。
  
• 根据平板的面积和胶的厚度估计需要配制的浓缩胶和分离胶的体积。并根据要分离的蛋白质的大小确定选择浓缩胶和分离胶的浓度，参考下表：
  

  蛋白质大小范围(kD)	最佳浓缩胶浓度	最佳分离胶浓度
  15-45	4%	15%
  15-60	4%	12.5%
  18-75	4%	10%
  30-120	4%	7.5%
  60-200	不需要	5%

  • 如果上样体积少于10μL，可以不需要浓缩胶。
• 配制10%的APS（过硫酸铵）：称0.1克过APS干粉到1mL去离子水中，摇晃溶解。没用完的10%APS溶液需4℃存放，一周后就不能再用。
  
• 配制分离胶溶液：在一个25mL的三角瓶中，先按下表的用量加入水、30%的AB溶液和4×分离胶缓冲液。以下是配制10mL胶的用量，更大体积则各成分用量需按比例增加。丙烯酰胺溶液有神经毒性，一定要戴手套操作。
  

  分离胶浓度	用量(mL)
  	水	30%AB溶液	4×分离胶缓冲液
  5%	5.83	1.67	2.50
  6%	5.50	2.00
  7%	5.17	2.33
  7.5%	5.00	2.50
  8%	4.83	2.67
  9%	4.50	3.00
  10%	4.17	3.33
  11%	3.83	3.67
  12%	3.50	4.00
  13%	3.17	4.33
  14%	2.83	4.67
  15%	2.50	5.00
  16%	2.17	5.33

• 配制浓缩胶溶液（一般使用4%的浓度）：在一个25mL的三角瓶中，先按下表的用量加入水、30%AB溶液和4×浓缩胶缓冲液。以下是配制10mL 4%浓缩胶的用量，丙烯酰胺溶液具有神经毒性，一定要戴手套操作。
  

  浓缩胶浓度	用量(mL)
  	水	30%AB溶液	4×浓缩胶缓冲液
  4%	6.17	1.33	2.50

• 将分离胶和浓缩胶溶液摇晃混匀，抽真空10～15分钟以去除溶液中的氧气。
  
  • 氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应，不去除将影响丙烯酰胺聚合反应，胶凝固时间会更长。
• 各加入50μL 10%APS和40μL TEMED，迅速摇匀。
  
  • 这是配制10mL分离胶和浓缩胶的用量，更大体积的胶则用量需按比例增加。
• 先灌分离胶，在分离胶的液面距离顶部1.5cm的时候，停止灌胶。
  
• 由于分离胶比重较大，可以立即在上面灌浓缩胶，但灌注时必须小心，不要破坏分离胶和浓缩胶的交接面，在浓缩胶液面达到顶部时停止灌胶，插入梳子，室温聚合30～60分钟。也可以等分离胶在室温聚合30～60分钟，胶凝固后再灌制。
  
• 拔出梳子，用1×SDS-PAGE电泳液冲洗加样孔。本制品提供20L的SDS-PAGE电泳液干粉，将所有干粉溶解在2L去离子水中即得10×SDS-PAGE电泳液，用时再用去离子水稀释成1×工作液。
  
  • 10×SDS-PAGE电泳液测pH应该在8.3，如果不是8.3务必用NaOH或HCl调到8.3。
• 将凝胶板固定在电泳装置上，往上下槽加入足够的1×SDS-PAGE电泳液。
  
• 在待电泳的蛋白样品中加入5×SDS-PAGE上样液(4μL样品加1μL上样液)，100℃煮沸3～5分钟。短暂离心，取上清上样。
  
• 先用10 mA的电流电泳（对0.75mm厚×14cm×14cm的胶)直到染料进入从浓缩胶进入分离胶。
  
• 将电流增加到15 mA，直到染料进入分离胶底部时终止电泳，取出凝胶进行后续的染色等实验处理。